本发明涉及组合物,其包含有效量的至少一种选自植物乳杆菌CECT 7527、植物乳杆菌CECT 7528及植物乳杆菌CECT 7529的菌株。这些新型菌株具有良好的益生菌特征,并可用于预防和/或治疗心血管障碍。
1.组合物,其包含有效量的至少一种选自植物乳杆菌CECT7527、植物乳杆菌CECT7528及植物乳杆菌CECT7529的具有降胆固醇活性的保藏菌株。
2.根据权利要求1的组合物,其包含有效量的菌株:植物乳杆菌CECT7527、植物乳杆菌CECT7528和植物乳杆菌CECT7529。
3.一种药学和/或兽医学产品,其包括有效量的根据权利要求1的组合物,以及适当量的药学或兽医学可接受赋形剂。
4.一种可食用产品,其包括有效量的根据权利要求1的组合物,以及适当量的其他可食用成分。
5.根据权利要求4的可食用产品,其为膳食补充剂。
6.根据权利要求5的可食用产品,其为营养制品。
7.根据权利要求4的可食用产品,其为片剂、胶囊、糖浆或丸剂的形式。
8.根据权利要求4的可食用产品,其为乳制品或肉制品。
9.根据权利要求1的组合物在制备用于预防和/或治疗包括人的动物的高胆固醇血症相关心血管障碍的药物中的用途。
10.根据权利要求9的用途,其中所述药物包括有效量的根据权利要求1的组合物与他汀类联合。
11.根据权利要求9的用途,其中所述包括人的动物是甾醇高吸收的。
12.根据权利要求1的组合物在制备用于降低包括人的动物的胆固醇的药物中的用途。
13.根据权利要求12的用途,其中所述药物包括有效量的根据权利要求1的组合物与他汀类联合。
14.根据权利要求12的用途,其中所述包括人的动物是甾醇高吸收的。本申请要求于2009年9月10日提交的欧洲专利申请09172613.3和于2009年11月30日提交的美国临时专利申请系列号61/265,095的权益。xa0发明领域本发明涉及医药、微生物学和营养学领域,具体而言涉及植物乳杆菌(Lactobacillusxa0plantarum)的新型益生菌菌株,其用于降低胆固醇。xa0
背景技术
异常的高胆固醇水平(高胆固醇血症)与心血管疾病有重大的关联,因为其促进动脉中粥样斑的发展。xa0潜在的降血胆固醇药物和食品得到持续开发以控制具有异常高水平胆固醇者的血清胆固醇。这些药物可基于中断胆汁盐的肠肝循环(EHC)。胆汁盐代谢和胆固醇代谢是紧密相关的。胆汁盐为胆固醇的水溶性分泌终产物,对消化道中乳化脂肪至关重要。其在肝脏中主要以甘氨酸-或牛磺酸-缀合物形式合成。一天内十二指肠中会数次分泌胆汁盐(平均为六次),其通过空肠进入回肠。在肠运输中,大多数胆汁盐被重吸收,通过门静脉回到肝脏。一小部分胆汁盐进入排泄物而损失,此损失部分在肝脏中由内源胆固醇进行新的合成。排泄物中损失的胆汁盐的量增加导致胆固醇新合成的增加,这样有效减少了内源胆固醇储存。当前使用的一组称为树脂的降胆固醇药物(消胆胺(Cholestyramine)、考来替泊(Colestipol)、考来维仑(Colesevelam))即通过此种作用机制发挥活性。xa0除了在药学上或手术上通过阻断EHC降低血清胆固醇水平的尝试之外,也有人提出摄入特定细菌细胞也可能影响胆固醇水平。肠细xa0菌可通过同化来自膳食的外源胆固醇进入细菌膜或通过去缀合胆汁盐而影响胆固醇水平。在肠运输中,胆汁盐经历了大量的细菌转化过程,其中最重要的是胆汁盐去缀合。在一些肠乳酸细菌(LAB)种属中存在去缀合(或水解)胆汁盐的能力,在其他一些属中也存在。胆汁盐去缀合时,甘氨酸或牛磺酸从分子的类固醇部分释放,形成游离(去缀合)的胆汁盐。游离胆汁盐在低pH下更易沉淀。其还比它们的缀合对应物能更不易有效地重吸收。因此,去缀合胆汁盐比结合胆汁盐更易分泌入排泄物中。胆汁盐去缀合通过增加胆汁盐的分泌而影响EHC,人们认为其对于减少血液胆固醇水平比仅仅滞留外源胆固醇更有效。xa0在数种摄入胃肠道的LAB种属中已经检测到胆汁盐水解酶(BSH)——在EHC过程中负责胆汁盐去缀合的酶。Tanaka等人(参照“Screeningxa0ofxa0Lacticxa0Acidxa0Bacteriaxa0forxa0Bilexa0Saltxa0Hydrolasexa0Activity”,Journalxa0ofxa0Dairyxa0Sciencexa01999,vol.82,p.2530-35)筛查了超过300株来自双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)以及乳酸乳杆菌(Lactococcusxa0lactis)、肠膜状明串珠菌(Leuconostocxa0mesenteroides)和嗜热链球菌(Streptococcusxa0thermophilus)种的LAB。对于273株菌得到的结果显示BSH活性在不同种之间分布不均一。根据此项研究,几乎所有双歧杆菌菌株具有BSH活性,而此活性只在选定的乳杆菌菌株中发现。xa0植物乳杆菌为革兰氏阳性耐氧性LAB,通常发现于发酵的食物产品以及厌氧性植物物质中。其还存在于唾液(它首次分离于此)中。由于其在工业加工和保质期内具有良好的存活率,还由于其具有高的酸化形式和良好的感官特性,植物乳杆菌菌株尤其适合于发酵食物产品的工业制备。还有一些植物乳杆菌菌株被认为是益生菌。益生菌为当以适当的量施用时能赋予宿主健康益处的活的微生物。细菌必须满足与以下条件相关的几方面要求才能称为益生菌:在到达下胃肠道(GIT)并粘附于肠道粘膜时没有毒性且具有有活力,等等。大多数益生细菌属于LAB组群,然而,一般已知的是益生菌特征和益处即使xa0在相同种的LAB中间都有极大的菌株依赖性。xa0通常将商业化植物乳杆菌299v菌株视为益生菌,且有描述其在以益生饮料形式摄入时,降低了血清中的纤维蛋白原和胆固醇水平(参照Bukowska等人,“Decreasexa0inxa0fibrinogenxa0andxa0LDL-cholesterolxa0levelsxa0uponxa0supplementationxa0ofxa0dietxa0withxa0Lactobacillusxa0plantarumxa0inxa0subjectsxa0withxa0moderatelyxa0elevatedxa0cholesterol”Atherosclerosisxa01998,vol.137,p.437-38)。然而,这些研究中的LDL-胆固醇减少很微弱,伴随HDL-胆固醇的类似微弱减少。没有发表过与植物乳杆菌299v的BSHA相关的数据。xa0因此,需要提供新型的改良益生菌菌株用作降血胆固醇试剂。xa0发明概述xa0本发明提供了新型的改良益生菌菌株用于降低血液胆固醇,并因此可用于预防和治疗心血管紊乱。xa0本发明者提供了三种分离自人排泄物的新型益生植物乳杆菌菌株。发现所述菌株具有惊人的高BSH活性。如前文提到的,高的细菌BSH活性与胆固醇减少之间存在有紧密联系,这使得本发明的菌株可用做降血胆固醇试剂。下文的工作实施例表明这些菌株与相关的商业可得的植物乳杆菌菌株相比具有显著更高的BSH活性,所述商业可得的植物乳杆菌菌株如植物乳杆菌299v或存在于商业益生菌混合物VSL#3中的植物乳杆菌株。还显示本发明的菌株对减少来自含可溶性胆固醇培养基的培养物胆固醇有效。尽管新型菌株中每种独自作用时都表现出相对已知菌株的优势,然而当所述三种菌株一同使用时这些优势得以放大,故显示出协同行为。xa0本发明菌株的降胆固醇活性也在体内得到证明。下文的实施例表明含有本发明的益生菌菌株的产品在施用给高胆固醇血症受试者时,对于减少其中胆固醇尤其有效。xa0因此,本发明第一个方面涉及包含有效量的至少一种选自植物乳杆菌CECTxa07527、植物乳杆菌CECTxa07528和植物乳杆菌CECTxa07529的菌株或其突变体菌株的组合物,其中突变体菌株是通过使用所述保藏菌株作为起始材料获得的,且其中突变体菌株保留或进一步提高母本菌株的降胆固醇活性。在一个具体的实施方式中,本发明涉及包含有效量的至少一种选自植物乳杆菌CECTxa07527、植物乳杆菌CECTxa07528和植物乳杆菌CECTxa07529的菌株或其突变体菌株的组合物。如本文所使用的,术语“有效量”指的是这样的量,活性试剂的量足够高以传递所需要的益处,但足够低以避免产生医学评价范围内的严重副作用。xa0本发明的另一个实施方式涉及包含有效量的植物乳杆菌CECTxa07527、植物乳杆菌CECTxa07528和植物乳杆菌CECTxa07529或其突变体菌株的组合物,其中所述突变体菌株是使用保藏菌株作为起始材料获得的,且其中所述突变体菌株保留或进一步提高了母本菌株的降胆固醇活性。在一个具体的实施方式中,本发明的组合物包含有效量的植物乳杆菌CECTxa07527、植物乳杆菌CECT7528及植物乳杆菌CECTxa07529。xa0清楚的是本领域技术人员可通过使用保藏菌株作为起始材料,常规地通过传统突变或再分离技术获得保留有本文描述的相关特征和优势的进一步的其突变体或衍生物。因此,术语“其突变体”涉及通过使用保藏菌株作为起始材料获得的突变体菌株,所述突变体菌株保留或加强了母本菌株的降胆固醇特性。本领域技术人员会决定采用合适的方法来确定菌株的降胆固醇活性。测量此活性的可能方法的实例在下文的实施例中显示。xa0本发明的菌株的优势在于其尤其可用作益生菌。如上文提到的,益生细菌必须满足与无毒、活力、粘附性及有益效应相关的几方面要求。这些益生菌特征甚至在相同种的细菌中都有菌株依赖性。因此,找出在所有益生菌要求上具有更好表现的菌株十分重要。下文的实施例表明本发明的菌株具有极好的益生菌特征。xa0本发明的菌株显示出对于哺乳动物胃肠环境的条件(酸性环境,高溶菌酶,胆汁盐和过氧化氢浓度)具有高度的抗性,因此能够在通过GIT的过程中存活。所述菌株还对肠上皮有良好的粘着性,这使得其能存留在肠道中并发挥其益生菌效应。与其他商业菌株相比,本发明的菌株显示了对GIT环境的更好的抗性以及更高的粘着能力。另外,其还显示出安全性,因为它们没有毒性效应;其不会导致LAB易位的增加,也不会促进宿主哺乳动物中肠细菌的易位。xa0进一步地,本发明菌株在宿主中具有数种有益效应。除了其降胆固醇活性之外,由于其拮抗活性,它们有益于肠道微生物群的平衡。术语“拮抗活性”指的是益生细菌的活性对胃肠非有益细菌的生长的抑制。具有胃肠微生物平衡失调的病况称为生态失调(disbiosis),这对人类的健康有多重负面后果。下文会显示所述菌株相比其他商业植物乳杆菌株具有更高的抑制病原菌株生长的能力。xa0所述菌株还产生大量的短链脂肪酸(SCFA)。由不可消化纤维生产出SCFA是一种有意义的益生能力。此种能力在益生菌中是很需要的,因为所产生的SCFA在宿主中显示出几种有益的特性(参照Wongxa0J.,“colonicxa0health:fermentationxa0andxa0shortxa0chainxa0fattyxa0acids”,Jxa0Clinxa0Gastroenterolxa02006,vol.40,p.235-43)。在SCFA中,丙酸和丁酸的产生对于本发明的内容具有更大的意义。所述第一种具有抗炎性效应,这在降低系统炎症上有用。全身炎症有可能导致动脉粥样化形成,动脉粥样化形成是最重要的心血管风险因素之一(参照Naruszewiczxa0M.,“Potentialxa0parapharmaceuticalsxa0inxa0thexa0traditionalxa0Polishxa0diet”2005,Journalxa0ofxa0Physiologyxa0andxa0Pharmacology,vol.56,supplxa01,p.69-78)。已知丁酸对结肠上皮有益,因为其是结肠细胞主要的能量来源。xa0由于其可在人类宿主中发挥数种有益的效应,这些益生细菌可用作治疗性或预防性试剂。具体而言,本发明的菌株有降低血液胆固醇水平的效果。如上文说明的,高胆固醇水平与心血管疾病紧密相关,因为其促进动脉中粥样斑的发展。因此,本发明的菌株可用于预防或治疗心血管障碍。xa0因此,本发明另一个方面涉及包含有效量的至少一种本发明的菌株或其突变体菌株的组合物,用作预防性和/或治疗性试剂。在一个优xa0选的实施方式中,本发明的组合物用于预防或治疗动物(包括人)的心血管障碍。在另一个实施方式中,本发明提供如上文描述的组合物在制备用于预防和/或治疗心血管障碍的药物中的用途。备选地,其可作为预防和/或治疗动物(包括人)心血管障碍的方法而配制,包括对需要其的所述的动物施用有效量的本发明的组合物。xa0在另一个实施方式中,将本发明的组合物用作降血胆固醇试剂。在一个进一步的实施方式中,本发明提供如上文描述的组合物在制备用于降低胆固醇的药物中的用途。备选地,其可作为降低动物(包括人)的胆固醇的方法而配制,包括对需要其的所述的动物施用有效量的本发明的组合物。xa0可将本发明的组合物施用给患有冠脉障碍的患者,也可以施用给健康受试者。在一个特定的实施方式中,接受本发明组合物的受试者患有高胆固醇血症。xa0本发明的益生菌组合物的进一步的优势在于没有植物甾醇呈现出的副作用,已有描述这些甾醇与他汀类联合使用在甾醇高吸收受试者中有不良后果。近期的证据表明在他汀类单一疗法中可见的一些残余冠心病风险是他汀类的后果,其实际上在甾醇(包括植物甾醇)高吸收者患者中增加冠心病风险。甾醇高吸收受试者达到人群的约25%,其中大多数显示包含腺苷-5’-三磷酸(ATP)结合盒(ABC)半转运子(half-transporter)ABCG8的多态性(Goldsteinxa0M等人,“Statins,plantxa0sterolxa0absorption,andxa0increasedxa0coronaryxa0risk”.Journalxa0ofxa0Clinicalxa0Lipidology,2008,vol.2,p.304-305)。进一步地,已经有人指出饮食性植物甾醇富集与他汀类疗法对于升高血液和组织的植物甾醇水平有叠加效果,并且这一点在甾醇高吸收者中尤其明显。本发明的益生菌组合物没有这些缺陷,并可与他汀类或任何其他降胆固醇药物联合施用给任何人群。xa0因此,在一个特定的实施方式中,将本发明的组合物施用给甾醇高吸收受试者。在另一个具体的实施方式中,本发明的组合物与他汀类联合施用。xa0本发明的菌株还促进宿主的免疫调制效应,因为其诱导肠粘膜产生改善的细胞因子谱(cytokinexa0pattern)。所述免疫调制效应对宿主有益,因为其有助于改善疾病抗性及减少过敏风险。已知GIT中生活的革兰氏阴性细菌在其细胞表面展示有LPS(脂多糖)分子,LPS诱导肠粘膜细胞产生炎性标记物。补充益生菌可改变这种情况,有助于具有更好的生态健康性或具有针对一些革兰氏阴性微生物的拮抗特性的革兰氏阳性细菌在GIT中更多存在(分组为乳酸细菌组群),因此降低了肠粘膜中存在的LPS。然而,一些益生微生物本身显示出调制细胞因子(其为调节体内炎性及免疫应答的信使分子)产生的能力。具体而言,一些益生细菌诱导了肠粘膜中促/抗炎性信号转导之间形成更好的平衡形式(而不降低革兰氏阴性细菌的数量)。如上文提到的,此种细菌刺激的免疫调制也具有抗动脉粥样化效应。xa0如下文要阐明的,有发现本发明的菌株本身能促进肠粘膜细胞产生的炎性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平下降以及抗炎性白介素-10(IL-10)水平的增加,从而诱导肠粘膜产生改善的细胞因子谱。此种免疫调制效应通过所述菌株的拮抗特性得以补充,在于减少GIT中病原性革兰氏阴性细菌的存在,并降低肠粘膜中LPS的量。xa0包含有效量的至少一种保藏菌株或其突变体的根据本发明的组合物可配制成可食用的、药学的或兽医学的产品,其中所述菌株是唯一的活性试剂或与一种或多种其他活性试剂混合和/或与药学或兽医学可接受赋形剂(在其为药学或兽医学产品的情况下)或合适的添加剂(在其为可食用产品的情况下)相混合。在本发明的一个具体的实施方式中,所述产品另外包含一种或多种进一步的活性试剂。优选地,添加的活性试剂为其他益生细菌。根据配方,这些菌株可以以纯化细菌、细菌培养物、细菌培养物的部分、已经过后处理的细菌培养物的形式,单独地或连同合适的载体或成分而添加。也可以添加益菌生(prebiotics),形成共生组合物。在一个具体的实施方式中,本发明的组合物另外包含选自低聚果糖和低聚半乳糖的益菌生。xa0在另一个方面,本发明提供了药学和/或兽医学产品,其包含有效xa0量的含有至少一种保藏菌株或其突变体菌株的组合物,还含有适当量的药学或兽医学可接受赋形剂。基于此种考虑,可将所述药学产品制备成以片剂、丸剂、胶囊、微胶囊、颗粒剂、混悬剂、糖浆、冻干粉剂、液体制剂等等的形式进行口服施用。出于所述组合物的特定目的,选择赋形剂及对于用于制剂的最适方法的在药学技术领域一般技术人员的能力范围之内。尽管口服施用是优选的方式,也可能采用其他的形式,如注射、直肠给药或局部施用。xa0如本文所使用的,术语“药学可接受的”指的是化合物、材料、组合物和/或剂型,其在良好的医学判断范围内适合用于与受试者(例如,人)的组织相接触而无多余毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症,并且同时具有合理的利弊比率。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相兼容的意义上也必须是“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可在标准药学课本中找到。类似地,术语“兽医学可接受的”指的是适合用于与非人动物的组织接触。xa0本发明的菌株还可包含在多种可食用产品中,如乳制品、酸奶、凝乳、乳酪(例如,夸克乳酪、奶油乳酪、加工乳酪、软和硬乳酪)、发酵乳、乳品粉末、乳基发酵产品、冰淇淋、基于谷物的发酵产品、乳品基粉末、饮品、调味品和宠物食品。在本文中术语“可食用产品”是以其最广泛的意义使用的,其包括可被动物摄取的任何呈现形式的任何类型的产品,但不包括药学和兽医学产品。其他可食用产品的实例为肉制品(例如,肝酱、法兰克福香肠和沙拉米香肠或肉酱(meatxa0spreads))、及巧克力酱、馅料(例如,松露、奶油)以及起霜制品(frosting)、巧克力、糖果(例如,饴糖(caramel)、软糖和太妃糖)、烘焙制品(蛋糕、点心)、沙司和汤、果汁及调咖啡白油(coffeexa0whiteners)。尤其感兴趣的可食用产品为膳食补充剂和婴儿配方食品。在本发明的意义上,膳食补充剂还包括营养制品(nutraceutical)——已知其为对人类健康有医疗作用的食品提取物。用于动物食品的饲料也包括在本发明范围之内。本发明的组合物还可用做其他食物产品的成分。xa0因此,在本发明的另一个方面,提供了包含本发明组合物连同适当量的可食用成分的可食用产品。优选地,本发明的组合物为膳食补充剂。xa0所述组合物中每种菌株的菌落形成单位(cfu)的有效量可由本领域技术人员确定并要取决于最终的制剂。例如,根据立法现状,可食用产品中的一种或多种菌株以大约10⁵cfu/g-大约10¹²cfu/g的量存在,优选地以大约10⁷cfu/g-大约10¹²cfu/g的量存在。术语“菌落形成单位”(“cfu”)定义为琼脂平板上通过微生物学计数显示的细菌细胞数量。xa0膳食补充剂通常含有量为10⁷-10¹²cfu/g范围内的益生菌菌株。在一个特定的实施方式中,本发明的组合物为膳食补充剂,其包括10⁹-10¹¹cfu/g,优选地为大约10¹¹cfu/g的所述保藏菌株。在另一个实施方式中,所述膳食补充剂包含10⁹cfu的本发明的一种或多种菌株株。xa0本发明的组合物的合适施用方案可由本领域技术人员确立。本发明的组合物可以一日一次、一周一次、每周数次或每日数次进行施用。在另一个实施方式中,每日剂量包含10⁹cfu的本发明的一种或多种菌株。xa0本发明的菌株是通过将细菌在合适培养基中并于合适条件下培养而生产的。所述菌株可单独培养以形成纯培养物,或和其他微生物一同作为混合培养物培养,或通过分开培养不同类型细菌然后将其以所需要的比例组合混合。在培养后,回收细胞悬液并如所述进行使用或以所需的方式处理,例如,通过浓缩或冻干,以进一步在制备药学或可食用产品中采用。有时益生菌制备物要经过固定化或封装加工以改善保质期。数种用于固定化或封装细菌的技术在本领域已知(参照Kailasapathy等人,“Microencapsulationxa0ofxa0Probioticxa0Bacteria:Technologyxa0andxa0Potentialxa0Applications”,Currxa0Issuesxa0Intestxa0Microbiolxa02002,vol.3,p.39-48)。xa0如果根据本发明的组合物是用作膳食补充剂,其可以以这样的方式施用——可与合适的可饮用液体(如水、酸奶、乳品或果汁)混合或可与固态或液态食品混合。在这种情况下,所述膳食补充剂可以为xa0片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、混悬剂、囊剂(sachet)、锭剂、糖果(sweet)、棒剂(bar)、糖浆和相应施用形式,通常为单位剂量形式。优选地,本发明组合物以片剂、胶囊、糖浆或丸剂形式施用,其以制备药学产品的常规工艺过程而制备。xa0如下文实施例中显示的,提供的菌株中每种与商业可得的植物乳杆菌菌株相比(如植物乳杆菌299v或植物乳杆菌VSL#3),都具有改善的特性。具体而言,由于其惊人的高BSH活性,这三种菌株具有改善的降血胆固醇效应。因此,这些菌株中每种都可用于本发明的组合物中,可以单独使用或与本发明其他菌株组合使用。例如,本发明的组合物可单独包含有效量的植物乳杆菌菌株CECTxa07527或同时包含其与药学可接受赋形剂、或可食用成分、防腐剂等等。并且,本发明组合物可包含有效量的植物乳杆菌菌株CECTxa07527和植物乳杆菌菌株CECTxa07528和/或植物乳杆菌菌株CECTxa07529,连同药学可接受赋形剂、或可食用成分、防腐剂,等等。xa0本发明一个进一步的方面提供了植物乳杆菌的菌株,其选自植物乳杆菌CECTxa07527,植物乳杆菌CECTxa07528和植物乳杆菌CECTxa07529构成的一组,或其突变体菌株,其中突变体菌株是通过使用保藏菌株作为起始材料获得的,且其中突变体菌株保留或进一步改善了母本菌株的降胆固醇活性。在一个具体的实施方式中,所述菌株选自保藏菌株中的一种。xa0以下章节描述了本发明菌株的降血胆固醇的能力,以及其分类学特征和其特异的益生菌特征,包括其对免疫系统的作用。这些实施例不意欲限制本发明。所得结果表明本发明的菌株与商业植物乳杆菌299v菌株相比,具有改善的益生菌特征。进一步地,显示了包含本发明菌株的组合物比已知的含植物甾醇的制剂,具有更好的体内降胆固醇活性xa0除非另有规定,本文使用的所有技术和科学术语都与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。与本文所描述的方法和材料类似的那些也可在本发明的实践中使用。xa0贯穿整个说明书和权利要求,词语“包含”及其变体不意欲排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。本发明另外的目标、优势及特征会在本领域技术人员检查本说明书时对其变得明显,或者通过对本发明的实践得到了解。以下实施例和附图以示例说明的方式提供,不意欲限制本发明。进一步地,本发明涵盖本文描述的具体和优选实施方式的所有可能的组合。xa0附图简述xa0图1.Sma-I(A)和Sfi-I(B)限制性消化1,植物乳杆菌299v;2,F2099;3,F3147;4,植物乳杆菌VSL#3;5,F3276的基因组DNA产生的脉冲场电泳图谱。xa0实施例1.新型菌株的体外降血胆固醇活性xa0本发明的菌株分离自婴儿排泄物,并且通过下文描述的方法进行胆汁盐水解酶(BSH)活性筛选中就其高性能在其他500种细菌菌株选择出。所选择的菌株显示了明显的革兰氏+染色,以及杆菌形态,而且不形成孢子。菌株根据的布达佩斯条约保藏于西班牙典型培养物保藏中心(Colecciónxa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="268"/>dexa0Cultivosxa0Tipo,CECT,Universidadxa0dexa0Valencia,Edificioxa0dexa0investigación,Campusxa0dexa0Burjassot,46100xa0Burjassot,Valencia)。发出了对应的存活证明且菌株得到以下的登记号:植物乳杆菌CECTxa07527(在本说明书中也称为F2099),植物乳杆菌CECTxa07528(在本说明书中也称为F3147),以及植物乳杆菌CECTxa07529(在本说明书中也称为F3276)。进入CECT的日期为:菌株F3276和F2099是2009年5月7日,菌株F3147为2009年7月15日。xa0进一步在体外研究所述菌株的降血胆固醇活性并与商业对照菌株,植物乳杆菌299v菌株(此处起称作Lpxa0299v)及商业VSL#3培养物中的植物乳杆菌菌株(此处起称作Lpxa0VSL#3)进行比较。如上文说明的,已有两种机制被描述用于降低乳酸细菌引起的胆固醇水平,即,胆汁xa0酸去缀合引起的胆固醇新合成及通过从膳食中同化外源胆固醇。因此,对所有菌株进行BSH活性测定以及培养物的降胆固醇测试。此外,对含有新型菌株不同组合的混合培养物进行测定以确定所述菌株间在BSH及培养物降胆固醇活性方面是否存在协同效应。实验步骤按Hyeong-Junxa0Lim等人(参照“Isolationxa0ofxa0cholesterolxa0loweringxa0lacticxa0acidxa0bacteriaxa0fromxa0humanxa0intestinexa0forxa0probioticxa0use”,Jxa0Vetxa0Scixa02004,vol.5,p.391-5)描述的方法进行,有轻微的变动。xa01.1.胆汁盐水解酶活性xa0将菌株在MRS肉汤(pHxa06.4)上于30°C,在含5%CO₂的气体条件中培养过夜。孵育后,将培养物标准化至10⁸cfu/ml并制备以下混合培养物:F2099+F3147,F2099+F3276,F3147+F3276,F2099+F3147+F3276。混合培养物含有等量的每种成分菌株且与单一菌株培养物具有相同的总细菌浓度。对单一菌株培养物和混合培养物都进行BSH活性测定。将培养物注入MRS琼脂平板(补充有4%(w/v)的牛磺去氧胆酸钠盐(TDCA,Sigma,USA)及0.37g/lxa0CaCl₂)上的灭菌圆纸片周围。将平板在无氧条件下于37°C孵育72h,并测量圆片周围沉淀区域的直径。然后通过由抑制区直径(IZD)减去圆片直径(DD)并将此差值除以2,根据公式GI=(IZD-DD)/2计算BSH活性(见表1)。xa0表1.胆汁盐水解酶(BSH)活性xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>这些结果表明本发明的菌株具有胆汁盐去偶联活性。进一步地,单一菌株菌株F2099、F3147和F3276中每种的BSH活性都比商业菌株xa0Lpxa0299v和Lpxa0VSL#3的活性高,最高的活性对应于菌株F3276。并且,在将菌株组合于混合培养物中时,对于相同的总细菌浓度,混合培养物的BSA活性比单一菌株培养物的活性高。当所述三种菌株组合时,BSH活性尤其有增加,产生了广泛两倍于Lpxa0299v的BSH活性。因此,在本发明的菌株之间在BSH活性方面似乎有协同效应。xa01.2.降培养基胆固醇能力xa0通过使用可溶胆固醇MRS肉汤进行降胆固醇测试。如上文阐述制备单一菌株培养物及混合培养物。将可溶胆固醇(聚氧乙烯胆固醇癸二酸盐,Sigma,USA)通过0.45μmxa0Millipore过滤,加入高压灭菌过的含0.05%L-半胱氨酸的MRS肉汤至终浓度300mg/ml。接种体积为15μl的如上文方式获得的细菌培养物溶液(10⁸cfu/ml)每1ml胆固醇-MRS肉汤,并将其在厌氧条件下于37°C孵育24h。未接种的MRS肉汤也在相同条件下孵育。孵育后,通过离心移除细菌细胞,然后在自动分析仪(Olympusxa0AU400)中测定植物乳杆菌培养物上清及未接种对照中剩余胆固醇含量。在含有1%w/v胆汁盐的MRS肉汤(胆汁盐来自SIGMAC4951)中进行相同的实验,所述最后一种组合更接近地类似于肠内环境。测定的结果见表2,并表示为相对未接种对照的胆固醇减少百分比。xa0表2.细菌培养物降低培养基胆固醇的能力。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>再次地,这些结果表明本发明的菌株与熟知的商业Lpxa0299v和菌xa0株Lpxa0VSL#3相比有更好的降血胆固醇作用。此外,有显示当将本发明三种菌株组合于混合培养物时降胆固醇效应更优。xa02.菌株的分类学特征xa0为进行分类学鉴定,将本发明的菌株在MRS培养基(pHxa06.4)中于30°C,含5%CO₂的气体条件下培养过夜。进一步收获细菌、将其于预裂解缓冲液(480μlxa0EDTAxa050mMxa0pHxa08.0;120μl溶菌酶(10mg/ml))中洗涤并重悬,并进一步在37°C下孵育60min。使用Wizard基因组DNA提取试剂盒(Promega)提取DNA。将预处理过的细菌在14000g下离心2min移除上清,之后按Promega的操作流程进行操作。简言之,将细菌于核裂解溶液(Nucleixa0Lysisxa0Solution)中重悬并于80°C下孵育5min,然后冷却至室温。将细胞裂解物在RNA酶溶液中于37°C孵育60min,通过加入蛋白质沉淀溶液(Proteinxa0Precipitationxa0Solution)并进行高速漩涡振荡以沉淀蛋白质。冷却样品并于15000g下离心3min。然后将含有DNA的上清转移至干净的1.5ml微量离心管并与600μl异丙醇颠倒混合。在15000g下离心2min以收集DNA,并小心倒出上清。加入600μl的70%乙醇轻柔颠倒离心管数次以洗涤DNA样品。在15000g下离心2min后通过抽气干燥移除乙醇。最后,加入100μl再水合溶液(Rehydrationxa0Solution)于65°C孵育1h以重新溶解DNA沉淀。样品储存于2-8°C。xa02.1.属和种的遗传鉴定xa0用通用引物Eub27f和Eub1492r通过PCR对16Sxa0rRNA进行扩增,产生几乎全序列16S的片段(超过1000个核苷酸)(表3)。然后,使用试剂盒Quiaquick(Quiagene)洗涤如上文阐述所获得的DNA。xa0使用BigDye试剂盒v.3.1及表3所示的引物用Geneticxa0Analyzerxa03130(Appliedxa0Biosystems)对每种样品进行四个连续的测序反应。使用DNAxa0Sequencexa0Analysisxa0v.5.2软件(Appliedxa0Biosystems)进行数据收集并建立色谱图(chromatogram),通过使用Chromas(Technelysiumxa0Ptyxa0xa0Ltd.)和BioEdit(Ibisxa0Biosciences)进行目视分析检查结果。xa0属鉴定是使用核糖体数据库项目(Ribosomalxa0Databasexa0Project)工具(Q.Wang等人,′′Naivexa0Bayesianxa0Classifierxa0forxa0Rapidxa0Assignmentxa0ofxa0rRNAxa0Sequencesxa0intoxa0thexa0Newxa0Bacterialxa0Taxonomy′′,Appl.Environ.Microbiol.2007,vol.73,p.5261-7)进行的。种鉴定是通过比较所获得的序列与来自RefSeq数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)(通过BLASTN方式比较)以及来自核糖体数据库项目(http://rdp.cme.msu.edu/,J.R.Cole等人,′′Thexa0Ribosomalxa0Databasexa0Project(RDP-II):introducingxa0myRDPxa0spacexa0andxa0qualityxa0controlledxa0publicxa0data′′Nucl.Acidsxa0Res.2007,vol.35,p.169-72)的已知生物体的16S序列而进行的。RDP工具鉴定出所述三种菌株F2099、F3147和F3276属于植物乳杆物种。xa0表3.用于扩增及测序16S基因的引物。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>2.2.菌株基因分型xa0通过基因组消化及脉冲场凝胶电泳进行表征。对F2099、F3147和F3276菌株进行先前文献所描述的操作流程(A.M.Rodas等人,′′Polyphasicxa0studyxa0ofxa0winexa0Lactobacillusxa0strains:taxonomicxa0implications′′,Intxa0Jxa0Systxa0Evolxa0Microbiolxa02005,vol.55,p.197-207)。测定中还包括Lpxa0VSL#3和Lpxa0299v,其用作对照菌株。所有菌株都在MRS琼脂平板上生长并于37°C,5%CO₂下孵育18h。收获细胞并在8mlxa0PET(10mMxa0Trisxa0pHxa07.6,1Mxa0NaCl)中洗涤3次,然后以6000rpm离心xa010min。用700μl裂解缓冲液(6mMxa0Tris,1Mxa0NaCl,0.1Mxa0EDTA,0.5%SLS,0.2%脱氧胆酸;1mg/ml溶菌酶;40U/ml变溶菌素;20(g/mlxa0RNA酶)重悬沉淀。将等体积的1.6%低熔点琼脂糖(FMCxa0BioProducts,Rockland,ME,USA)加至重悬细胞,在4°C进行1h的固化作用。将插入片段转移至2ml裂解缓冲液II(0.5Mxa0EDTAxa0pH9.2,1%N-十二烷基肌氨酸和1mg/ml链霉蛋白酶)并于50°C孵育48h。然后在室温下用TE缓冲液(10mMxa0Tris,1mMxa0EDTAxa0pH8.0)洗涤插入片段。用限制性内切酶Sfi-I和Sma-I(Rochexa0Diagnostics)对总DNA进行消化。xa0使用CHEFxa0DRIII设备(BioRadxa0Laboratories)进行脉冲场电泳。将插入片段上样于1%的琼脂糖凝胶(SeaKemxa0MExa0agarose,FMCxa0BioProducts,ME,USA)中。表4描述了每种酶的电泳条件。DNAxa0MW标志物为λ梯度PFG标志物(Lambdaxa0ladderxa0PFGxa0Marker)和低分子量PFG标志物(Lowxa0Rangexa0PFGxa0Marker,Newxa0Englandxa0Biolabs)。电泳后,用溴化乙锭对凝胶染色,并使用GelDoc系统(BioRad)进行UV分析。xa0表4.用于F2099、F3147和F3276菌株的DNA的Sfi-I和Sma-I限制性基因组的电泳条件。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>如图1中显示的,F2099、F3147和F3276菌株的脉冲场电泳的Sfi-I和Sma-I限制性酶切谱型不同,因此确定其属于三种不同的菌株。如所预期的,这些谱型也与Lpxa0299v和Lpxa0VSL#3菌株的谱型不同。文献中已经描述与其他乳酸杆菌不同,植物乳杆菌种显示出高度的遗传异质性(I.Sánchez等人,“Polyphasicxa0studyxa0ofxa0thexa0geneticxa0diversityxa0ofxa0lactobacillixa0associatedxa0with′Almagro′eggplantsxa0spontaneousxa0fermentation,basedxa0onxa0combinedxa0numericalxa0analysisxa0ofxa0randomlyxa0amplifedxa0polymorphicxa0DNAxa0andxa0pulsed-fieldxa0gelxa0electrophoresisxa0patterns”Journalxa0ofxa0Appliedxa0Microbiologyxa02004,vol.97,p.446-58)。xa0如其PFGE所显示,菌株F2099、F3147和F3276在遗传学上看上去关系非常紧密,因此其可能来自相同的克隆起源(F.C.Tenover等人,“Interpretingxa0chromosomalxa0DNAxa0restrictionxa0patternsxa0producedxa0byxa0pulsed-fieldxa0gelxa0electrophoresis:criteriaxa0forxa0bacterialxa0strainxa0typing”Jxa0Clinxa0Microbiolxa01995,vol.33,p.2233-9)。xa03.对胃肠环境的抗性xa0为评估F2099、F3147和F3276菌株对转运通过GIT的抗性,在模拟哺乳动物胃肠环境的条件下进行测定。因此,在以溶菌酶、过氧化氢、酸性环境和胆汁盐处理后对存活情况进行定量。将结果与Lpxa0299v和Lpxa0VSL#3所得结果进行比较。xa03.1.对溶菌酶的耐受性:将在MRS中37°C下培养过夜的每种细菌培养物取20μl的等份试样置于96孔板中,并加入200μl补充有100、200或300μg/ml溶菌酶(Sigma)的培养基。将板于37°C,5%CO₂下孵育。通过用ELISA读数仪测量0和6h的孵育时间之间620nm的光学密度的增加而定量细菌生长量。结果表示为相对于对照的百分比,对照是每种菌株在没有补充溶菌酶的MRS肉汤中的最大生长量(表5)。xa03.2.对过氧化氢的耐受性:将在MRS中37°C下培养过夜的每种细菌培养物取20μl的等份试样置于96孔板中。加入200μl补充有10、20及30μg/mlH₂O₂的MRS,将板于37°C孵育30min,然后在0和6h孵育时间后读出620nm的光学密度值(表6)。xa03.3.对酸性环境的耐受性:将在MRS中37°C下培养过夜的每种细菌培养物取20μl的等份试样置于96孔板中,然后将200μl等份试样的以HCl调节至不同pH值的MRS培养基加入含有细菌的孔上。然后将板保持在42°C,并用分光光度计读出0和6h之间620nm的光学密度的增加。结果表示为相对于对照的百分比,对照是每种菌株在pH7.2的MRS肉汤中的最大生长量(表7)。xa03.4.对胆汁盐的耐受性:将在MRS中37°C下培养过夜的每种细菌培养物取20μl的等份试样置于96孔板中。将200μl补充有0.3%、0.5%xa0和0.1%(w/v)胆汁盐(SIGMAxa0B8756-10G,096K1213)加入孔中并调整至pH3。也测定在200μl补充有0.3%(w/v)胆汁盐而未调整pH的MRS中的样品。将板保持在37°C,5%CO₂下,并在0和6h时用分光光度计在620nm处进行读取(表8)。xa0表5.在不同溶菌酶浓度下孵育后的光学密度(OD)结果,以对照MRS的百分比表示xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表6.在不同H₂O₂稀释度下孵育后的光学密度(OD)结果,以对照MRS的百分比表示xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表7.在不同pH值下孵育后的光学密度(OD)结果,以对照MRS的百分比表示xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表8.在不同胆汁盐浓度下孵育后的光学密度(OD)结果,以对照MRS的百分比表示。^*无pH调整。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>这些结果表示本发明的菌株在置于模拟胃肠环境的条件下时具有良好的活力表现。表5和6显示了所述菌株对口中存在的高浓度杀细菌试剂(溶菌酶和过氧化氢)有抗性。即使在高于生理条件的浓度下(30μg/ml溶菌酶及10μg/mlxa0H₂O₂),仍有很好的菌株活力。在胃的酸性条件下,菌株的活力也令人满意。进一步地,本发明的菌株对胆汁盐具有出色的抗性(见表8),即使同时为酸性pH(这也经常是胃排空发生时的情况)时也是如此。总体而言,这些结果显示本发明的菌株在通过GIT后仍然有活力。此外,这些结果显示本发明的菌株比商业菌株Lpxa0799v和Lpxa0VSL#3在测定条件下有更好的表现。xa04.对肠的粘着xa04.1.对粘膜的粘着xa0将F2099、F3147和F3276菌株的粘着能力与商业菌株Lpxa0299v的粘着能力相比较。xa0用pH7.4的PBS,0.01%明胶及蛋白酶抑制剂(Completexa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="65"/>Sigma)洗涤肠得到粘膜。将粘膜刮下并储存于有缓冲液10mMxa0pH7.4的HEPES-Hank’s盐及相同抑制剂的容器中。然后将粘膜在相同缓冲液中以13000rpm离心10min进行洗涤。回收上清液并通过Bradford法估测粘膜含量。xa0按如下方法制备氚标记培养物。取150μl各微生物的无菌培养物加入补充有氚标记胸腺嘧啶的MRS培养基中(5μl每3mlxa0MRS)并在xa030°C,5%CO₂下孵育过夜。对制备物进行离心并将沉淀于PBS缓冲液中重悬至10⁸cfu/ml的浓度。以起始氚信号(加至培养基的氚标记胸腺嘧啶的μl数)和上清信号计算渗入微生物的氚信号。此数量(渗入生物质的信号)与培养物中总微生物数量之比得到dpm/cfu(信号/细菌)。xa0在粘着测定前24h,将1ml粘膜溶液(0.5mg/ml)于ELISA板的孔中孵育。洗涤后,将1xxa010⁸cfu/ml的氚标记微生物制备物加入孔中并在37°C下孵育60min。移除各孔的上清,用MEMxa0Alpha培养基(Gibco)洗涤各孔,并刮下以释放孔中的粘膜-微生物。通过用闪烁计数仪(Wallacxa01410)计量各孔中粘膜-微生物制备物的氚信号,并将其除以上文获得的dpm/cfu值计算菌株的粘着性。结果为每单位粘膜面积粘着的细菌数量。菌株F2099、F3147和F3276可结合于2cm²的肠粘膜的量分别为6.80xxa010⁵、6.58xxa010⁶和7.31xxa010⁶cfu。与Lpxa0299v商业菌株相比较,本发明菌株有更好的粘着能力。xa04.2.对Caco-2细胞的粘着性xa0自美国典型培养物保藏所(ATCC)获得Caco-2xa0ECACCxa0N^o:86010202细胞。获得每单位caco-2细胞面积粘附的细菌数的实验步骤基本上与上文描述的用于测量粘膜粘着性的步骤相同。结果显示菌株F2099、F3147和F3276可结合于2cm²的caco-2细胞的数量分别为3.12xxa010⁶、2.11xxa010⁶和5.19xxa010⁵cfu。再次地,与Lpxa0299v商业菌株相比较,本发明菌株有更好的粘着能力。xa05.毒性测定xa0将F2099、F3147和F3276菌株的预固定混合培养物(此混合培养物从此处起称为AB-LIFE)在PBS中以5x10¹⁰cfu/kg连续两天施用给六只9周龄Wistar大鼠(雄性和雌性)至总剂量10¹¹cfu/kg。动物自由摄食饲料(Teklacdxa02014)和水。在饱食后以口胃管协助进行施用。对6只对照大鼠应用相同的喂食方案,其只接受单独的PBS。每两天通过测量如体重、行为和对刺激的应答等参数的值确定动物的健康状况。xa0从每个参数所得值的总和得到总分:体重+行为+对刺激的应答。总体上,在此研究中没有观察到对动物健康有负面效应。xa0在第7天通过CO₂吸入处死动物。进行完全的尸体解剖以找出宏观器官损害。取肠系膜淋巴结和肝脏样品测定细菌易位。将大约5mg的每种样品于1mlxa00.01%明胶PBS中匀浆化。从此匀浆中取100μl铺于McConkey平板或MRS平板上。在37°C孵育48h后对菌落进行计数。结果显示在表9和表10中。在MRS平板上观察到对照和喂食AB-LIFE的动物的少数LAB菌落对应于LAB的正常基础易位(J.S.Zhou等人,“Acutexa0oralxa0toxicityxa0andxa0bacterialxa0translocationxa0studiesxa0onxa0potentiallyxa0probioticxa0strainsxa0ofxa0lacticxa0acidxa0bacteria”,Foodxa0Chemxa0Toxicolxa02000,vol.38,p.153-61)。xa0总而言之,结果显示口服施用AB-LIFE培养物是安全的,因为其不导致LAB易位的增加,也未促进肠细菌易位。所有动物在整个研究中显示了相似的体重生长情况。在饲料和水的摄取上未观察到显著差异。没有检测到临床症状或动物健康状况的变化。在组织病理学检查中未检测到器官和腔体的宏观损害。xa0表9.向AB-LIFE喂食动物肝脏的细菌易位。数值表示具有阳性细菌生长的动物数及组织cfu/mg的最大值。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表10.向AB-LIFE喂食动物肠系膜淋巴结的细菌易位。数值表示具有阳性细菌生长的动物数及组织cfu/mg的最大值。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>6.拮抗特性xa0为评估菌株F2099、F3147和F3276是否呈现出拮抗活性,用Oxoid培养基中的细菌病原体接种琼脂平板进行Campbell法测定。此研究中使用的病原体选自人胃肠道中通常存在的病原体(见表11)。对平板进行一致的涂布并在5%CO₂培养箱中于合适的温度下培养至汇合。然后,在一致接种的汇合的F2099、F3147或F3276琼脂平板中取圆柱体部分置于病原体平板上并于37°C下孵育过夜。xa0第二天,通过将所述琼脂平板置于平尺(flatxa0rule)上测量抑制区域。通过以抑制区域直径(IZD)减去圆柱直径(CD)并将此差值除以2,根据公式GI=(IZD-CD)/2计算生长抑制活性。将本发明菌株与商业菌株Lp299v和Lpxa0VSL#3的抑菌能力进行比较。xa0表11.根据上文说明的公式得到的生长抑制值。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>F2099、F3147和F3276菌株抑制了表11中显示的大多数病原性菌株的生长。因此,其由于有抑制病原性菌株生长的能力而对肠的微生物群平衡有益。本发明的菌株与商业对照菌株相比具有总体上更好的拮抗特性。xa07.肠粘膜模型中对产生细胞因子的免疫调制能力进行体外评估xa0所选择的粘膜模型为单核细胞系THP-1,因为其对细菌组分如LPS(作为炎性应答的诱导物)敏感,并且当培养基中有适合诱导产生抗炎细胞因子谱的分子时其对细胞因子产生的调制作用敏感。xa0在24孔ELISA平板内在DMEM培养基中培养THP-1细胞(获自ATCC)的至终浓度为约10⁶单核细胞/孔。在加入细菌菌株前以10ng/mlxa0LPS对细胞进行2.5h的刺激。此前F2099、F3147、F3276和Lpxa0299v菌株在37°C、5%CO₂的气体条件下于MRS培养基中培养过夜。孵育后,使用Neubauer计数小室计算微生物浓度,并对其进行适当稀释以达到ELISA孔中500μl的DMEM中与THP-1细胞终比例为25∶1(2.5xxa010⁷)cfu/单核细胞。各稀释物都是用补充有庆大霉素(50μg/ml)、氨苄青霉素(10μg/ml)和氯霉素(12μg/ml)的DMEM培养基产生的。xa0THP-1细胞与植物乳杆菌菌株共同孵育24小时,在6小时及实验结束时取等分试样进行进一步分析。离心等分试样并通过根据制造商说明使用商业试剂盒Humanxa0Solublexa0Proteinxa0Masterxa0Buffer(BDxa0Cytometricxa0Beadxa0Array)进行流式细胞术以测定上清的TNF-α和IL-10。xa0为解释所得结果,获得6和24小时得到的数值的斜率并对其标准化。标准化的斜率是根据以下制造商提供的公式计算出的:xa0NS=((1-24h的IL值/6h的IL值)/24)x100;xa0其中NS为标准化斜率,IL(或TNF-α)值为6或24小时时IL-10或TNF-α的浓度。结果表示为pg/ml。xa0由于要获得可在实验间进行横向比较的标准值(表12)故选择此xa0方法,因为细胞因子浓度的变化比其绝对值(pg/ml)更有意义。6小时获得的值表示THP-1细胞仍然在受LPS的诱导;之后,TNF-α浓度升高,IL-10浓度降低。在24小时有可能观察到细胞因子产生谱的逆转(TNF-α减少而IL-10增加)。xa0表12.标准化斜率,其表示LPS诱导的THP-1细胞中IL-10和TNF-α的诱导(正斜率)或抑制(负斜率)。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>如表12所显示的,LPS诱导的THP-1细胞在植物乳杆菌菌株存在下诱导IL-10的产生,在菌株F3276存在下对IL-10的诱导尤其高。此外,F2099、F3147和F3276与商业Lpxa0299v相比较对于产生炎性TNF-α具有更高的抑制活性。xa08.短链脂肪酸产生xa0为测定丙酸和丁酸的产生,本发明的菌株和对照菌株在补充有1%w/v的下列各纤维的基础培养基中培养:菊粉(SIGMAxa0I2255)、果胶(SIGMAxa076282)及低聚果糖(FOS)(SIGMAxa0F8052),这些都是日常膳食中通常存在的纤维。基础培养基的组成见于表13。培养基在厌氧的气体条件下预孵育12小时。在用各Lp菌株进行接种后,培养基在厌氧条件下于37°C孵育过夜。然后对过夜培养物进行离心并将上清迅速于液氮中冷冻用于随后在Agilentxa01100色谱仪上使用Tracerxa0Extrasilxa0ODS2(3μm,15x0.4cm)反相柱进行HPLC分析。样品的丙酸和丁酸浓度可见于表14。xa0表13.基础培养基组合物xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表14.生长于含有菊粉、果胶和FOS的基础培养基的植物乳杆菌菌株的丙酸和丁酸产生情况。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>从上文结果可得出推论本发明的菌株产生大量的丙酸和丁酸,从而对宿主生物发挥有益的效应。xa09.体内降血胆固醇活性xa0以随机化、双盲、安慰剂对照、平行临床试验的形式对本发明的益生菌组合物在高血胆固醇受试者中的降胆固醇效应进行研究。本研究此外包含了进一步的心血管相关参数,以及所述益生菌组合物的耐受性与其感官特性。xa060名年纪在18-65岁之间的高血胆固醇受试者参加了研究。参加者的体质指数(BMI)在19-30Kg/m²之间,总血清胆固醇(总-C)为200-300mg/dl并且低密度胆固醇(LDL-C)为130-190,除去表现出两项或多项心血管风险因素的受试者之外,对于其的LDL-C为100-190mg/dl。参加者中没有人在研究前四周内受到任何类型的降血胆固醇治疗。将具有高于350mg/dl的高三甘油酸酯血症或在研究开始前6个月内有心血管缺血性发作的受试者排除在外。怀孕或哺乳女性及对所述组合物的任何组分过敏的受试者也排除在外。男性和女性受试者之间的差异不高于20%。所有参加者都提供一份书面的知情同意书以参加研究,研究流程得到独立的伦理委员会的审查和认可。xa0在12周内,参加者服用唯一的口服日剂量的对照组合物(安慰剂)或包含1.2*10⁹cfu的本发明的三种菌株F2099、F3147和F3276等量混合培养物的益生菌组合物(AB-LIFExa02)。安慰剂及AB-LIFE组合物的配方见于表15。两种组合物都以植物明胶胶囊的形式施用。受试者的LDL-C、总-C、LDL/HDL、氧化LDL、甘油三酯、动脉张力、基础血糖、体重、腰臀指数、身体脂肪和健康状况在整个研究中得到监视。进一步地,评估所述组合物的感官特性和耐受性。使用SPSS程序对AB-LIFExa02益生菌组和安慰剂组测得的数值进行统计分析。xa0表15.益生菌AB-LIFExa02和安慰剂组合物的制剂(每胶囊中mg值)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>临床试验结果显示于表16和17。安慰剂和益生菌组在治疗前后的总-C、LDC-C和氧化LDL的平均值及标准偏差都见于表16。减少的百分比和组别之间的统计学分析显示于表17。xa0因此得出结论AB-LIFExa02是有效的降血胆固醇试剂。此外,在与具有类似意义的产品如植物甾醇相比较,食用AB-LIFExa02造成的总-C减少量更高。(Planaxa0N.等人,“Plantxa0sterol-enrichedxa0fermentedxa0milkxa0enhancesxa0thexa0attainmentxa0ofxa0LDL-cholesterolxa0goalxa0inxa0hypercholesterolemicxa0subjects”,Eurxa0Jxa0Nutr.,2008,vol.47,p.32-39)。xa0表16.总-C、LDL-C及氧化LDL的平均值和标准偏差。t0,基线值;tf,12周治疗结束时的值。xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表17.益生菌AB-LIFE组中总-C、LDL-C和氧化LDL减少百分比(及组间统计学分析)xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本申请引用文献xa0Tanakaxa0H,Doesburgxa0K,Iwasakixa0T,Mierauxa0I,“Screeningxa0ofxa0Lacticxa0Acidxa0Bacteriaxa0forxa0Bilexa0Saltxa0Hydrolasexa0Activity”.Journalxa0ofxa0Dairyxa0Sciencexa01999,vol.82,p.2530-35.xa0Bukowskaxa0H,Pieczul-Mrózxa0J,Jastrzebskaxa0M,Chelstowskixa0K,Naruszewiczxa0M,“Decreasexa0inxa0fibrinogenxa0andxa0LDL-cholesterolxa0levelsxa0uponxa0supplementationxa0ofxa0dietxa0withxa0Lactobacillusxa0plantarumxa0inxa0subjectsxa0withxa0moderatelyxa0elevatedxa0cholesterol”.Atherosclerosisxa01998,vol.137,p.437-38.xa0Wongxa0JM,dexa0Souzaxa0R,Kendallxa0CW,Emamxa0A,Jenkinsxa0DJ,“colonicxa0health:fermentationxa0andxa0shortxa0chainxa0fattyxa0acids”.Jxa0Clinxa0Gastroenterolxa02006,vol.40,p.235-43.xa0Naruszewiczxa0M,Kozlowska-Wojciechowskaxa0M,“Potentialxa0xa0parapharmaceuticalsxa0inxa0thexa0traditionalxa0Polishxa0diet”.Journalxa0ofxa0Physiologyxa0andxa0Pharmacologyxa02005,vol.56,supplxa01,p.69-78.xa0Goldsteinxa0M,Mascitellixa0L,Pezzettaxa0F,“Statins,plantxa0sterolxa0absorption,andxa0increasedxa0coronaryxa0risk”.Journalxa0ofxa0Clinicalxa0Lipidology,2008,vol.2,p.304-305.xa0Kailasapathyxa0K,“Microencapsulationxa0ofxa0Probioticxa0Bacteria:Technologyxa0andxa0Potentialxa0Applications”.Currxa0Issuesxa0Intestxa0Microbiolxa02002,vol.3,p.39-48.xa0Limxa0Hxa0J,Kimxa0SY,Leexa0WK,“Isolationxa0ofxa0cholesterolxa0loweringxa0lacticxa0acidxa0bacteriaxa0fromxa0humanxa0intestinexa0forxa0probioticxa0use”.Jxa0Vetxa0Scixa02004,vol.5,p.391-5.xa0Wangxa0Q,Garrityxa0GM,Tiedjexa0JM,Colexa0JR,′′Naivexa0Bayesianxa0Classifierxa0forxa0Rapidxa0Assignmentxa0ofxa0rRNAxa0Sequencesxa0intoxa0thexa0Newxa0Bacterialxa0Taxonomy′′.Appl.Environ.Microbiolxa02007,vol.73,p.5261-7.xa0RefSeqxa0dataxa0base,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/xa0Ribosomalxa0Databasexa0Project,http://rdp.cme.msu.edu/xa0Colexa0JR,Chaixa0B,Farrisxa0Rxa0J,Wangxa0Q,Kulam-Syed-Mohideenxa0AS,McGarrellxa0DM,Bandelaxa0AM,Cardenasxa0E,Garrityxa0GM,Tiedjexa0JM,′′Thexa0Ribosomalxa0Databasexa0Projectxa0(RDP-II):introducingxa0myRDPxa0spacexa0andxa0qualityxa0controlledxa0publicxa0data′′Nucl.Acidsxa0Res.2007,vol.35,p.169-72.xa0Rodasxa0AM,Ferrerxa0S,Pardoxa0I,′′Polyphasicxa0studyxa0ofxa0winexa0Lactobacillusxa0strains:taxonomicxa0implications′′,Intxa0Jxa0Systxa0Evolxa0Microbiolxa02005,vol.55,p.197-207.xa0Sánchezxa0I,xa0ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="183"/>S,Palopxa0LL,“Polyphasicxa0studyxa0ofxa0thexa0geneticxa0diversityxa0ofxa0lactobacillixa0associatedxa0with′Almagro′eggplantsxa0spontaneousxa0fermentation,basedxa0onxa0combinedxa0numericalxa0analysisxa0ofxa0randomlyxa0amplifiedxa0polymorphicxa0DNAxa0andxa0pulsed-fieldxa0gelxa0electrophoresisxa0patterns”,Journalxa0ofxa0Appliedxa0Microbiologyxa02004,vol.97,p.446-58.xa0Tenoverxa0FC,Arbeitxa0RD,Goeringxa0RV,Mickelsenxa0PA,Murrayxa0BE,Persingxa0DH,Swaminathanxa0B,“Interpretingxa0chromosomalxa0DNAxa0restrictionxa0patternsxa0producedxa0byxa0pulsed-fieldxa0gelxa0electrophoresis:criteriaxa0forxa0bacterialxa0strainxa0typing”Jxa0Clinxa0Microbiolxa01995,vol.33,p.2233-9.xa0Zhouxa0JS,Shuxa0Q,Rutherfurdxa0KJ,Prasadxa0J,Gopalxa0PK,Gillxa0HS,“Acutexa0oralxa0toxicityxa0andxa0bacterialxa0translocationxa0studiesxa0onxa0potentiallyxa0probioticxa0strainsxa0ofxa0lacticxa0acidxa0bacteria”,Foodxa0Chemxa0Toxicolxa02000,vol.38,p.153-61.xa0Planaxa0N,Nicollexa0C,Ferrexa0R,Campsxa0J,Cosxa0R,Villoriaxa0J,Masanaxa0L;DANACOLxa0group,“Plantxa0sterol-enrichedxa0fermentedxa0milkxa0enhancesxa0thexa0attainmentxa0ofxa0LDL-cholesterolxa0goalxa0inxa0hypercholesterolemicxa0subjects”,Eurxa0Jxa0Nutr.,2008,vol.47,p.32-39.xa0